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Laboratorio #2

Punto isoeléctrico de aminoácidos y proteínas.

Objetivos.

1.         Determinar los pKa de un aminoácido polar con carga y un aminoácido no polar, mediante titulación con álcali.

2.         Estimar el punto isoeléctrico de los aminoácidos polares y no polares del gráfico de pH vs volumen de base.

3.         Determinar el punto isoeléctrico de una proteína mediante  la técnica de precipitación.

Resumen.

En la experiencia a realizar se determinara el punto isoeléctrico de la glicina mediante la titulación con un patrón de NaOH, también se determinara el punto isoeléctrico de la caseína de la leche titulando con HCl. En los aminoácidos,  la presencia de grupos ácidos y básicos asume diferentes estructuras dependiendo el pH del medio  en que se encuentran. Para las proteínas existe un valor de pH para el cual las cargas positivas y negativas  están completamente balanceadas.

Introducción.

El punto isoeléctrico se refiere al pH en el cual una sustancia se comporta como ácido y base  simultáneamente. El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el número de cargas positivas se iguala al número de cargas negativas que aportan los grupos ionizables de una molécula. En el punto isoeléctrico la carga neta de la molécula es cero (0). En los aminoáci­dos los grupos ionizables corresponden a grupos carboxilos, amino, fenólicos y tiólicos.

El pI de los a-aminoácidos monoamino-monocarboxílicos, siempre está cercano a pH = 6. Este valor lo podemos calcular con la siguiente ecuación: pH intermedio entre los valores de pKa de los grupos carboxílicos y en el caso de los á-aminoácidos diamino-mo            El pI de los á-aminoácidos monoamino-dicarboxílicos se encuentra a un nocarboxí­licos entre los valores de pKa de los grupos amino.

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de grupos ionizables en estas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la solubilidad.

Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares no presentan carga neta y cristali­zan en forma de sales insolubles a ese pH.

Materiales

Bureta

Pipetas 25ml

Pinzas de Buretas

Potenciometro

Soporte

Matraces 125ml y 250ml

Reactivos.

Reactivos.	Masa	Punto de fusión	Toxicidad
Acido glutámico	147,13	1990C	Desconocida
Glicina al 0.5%	75.07	235,850C	Desconocida
HCl 0.1M	36	1010C	Toxico, irritante.
NaOH 0.2M	40	3190C	Corrosivo en piel
Etanol 95%	46	-114,30C	Afecta el sistema del mar.

Procedimiento:

 A.1) Titulación de aminoácidos:

Coloque una alícuota de 25 ml de la solución de aa. en un vaso químico de 250 mL y proceda a titular con NaOH 0.2 M, con adiciones de 1.0 mL cada vez, midiendo el pH antes de cada adición con un potenciómetro de pH, hasta alcanzar el pH de 10. Grafique sus resultados y reporte los valores de pKa de los aminoácidos analizados y calcule el pI en cada caso.

A.2) Punto isoeléctrico y solubilidad:

Verifique la solubilidad de varios aminoácidos en el punto isoeléc­trico. Para ello, utilice una pequeña muestra de cristales del aa. y trátelo de disolver en soluciones de fosfato que se encuentren en el pH correspondiente al punto isoeléctrico. Compare sus resultados con la solubilidad en agua.

 B1) Determinación del pI de la caseína de la leche.

Mida 50 mL de leche y colóquelos en un vaso químico de 400 mL. Diluya con 150 mL de agua destilada. Titule con HCl al 2% hasta alcanzar el pH de 4.8 contra un potenciómetro de pH. Si se tiene cuidado, se observa fácilmente el punto en el cual empieza a precipitar la proteína de la leche (caseína). Se agita durante 10 minutos, se deja sedimentar media hora  y se anotan los resultados.

 B.2) Separación de la caseína: (opcional)

Se decanta el sobrenadante de la leche precipitada en el punto 4.2. El precipita­do se lava dos veces por suspensión con 100 mL de agua destilada y nueva decantación.  Se succiona toda el agua por filtración en embudo Büchner. El residuo húmedo se pasa a un vaso químico y se prepara una suspensión final de caseína en 50 mL de  etanol al 95% y se agita con fuerza durante 5 minutos y se decanta. Se repite otra vez el extracto con alcohol y luego se extrae dos veces con  30 mL de éter.

 NOTA: descarte el éter en un recipiente para residuos orgánicos. Se filtra la suspensión y se deseca sobre una placa porosa. Se debe obtener un polvo blanco muy ligero.

Esquema experimental.

Titulacion de Aminoácidos

Punto Isoeléctrico y Solubilidad.

Determinar PI de la caseína de la leche.